Morpholino

Dans la biologie moléculaire , un Morpholino est un genre de molécule employée pour modifier l'expression de gène . Les oligonucléotides (oligos) de de Morpholino sont une technologie antisens du employée pour bloquer l'accès d'autres molécules aux ordres spécifiques dans l'acide nucléique . Régions de bloc de Morpholinos petites (base ~25) des surfaces de base-appareillement de l'acide ribonuclétique (ARN ). Morpholinos désigné parfois sous le nom de BGP (morpholino de de phosphorodiamidate oligo). Le " de mot ; morpholino" ; peut se produire dans d'autres noms chimiques, se rapporter à des produits chimiques contenant un anneau six-membered de la morpholine ; cet article discute seulement les oligos antisens de Morpholino.

Morpholinos sont habituellement employés comme outil de recherches pour la génétique d'inverse de par le démantelant la fonction de gène de . Ceci est réalisé en empêchant des cellules de faire une protéine visée ou en modifiant le épissant du Pré-ADN messagère . Démanteler l'expression de gène est une méthode puissante pour se renseigner sur la fonction d'une protéine particulière ; pareillement, entraînant à un Exon de détail être épissé hors d'une protéine peut aider à déterminer la fonction de la partie codé par de protéine par cet exon. Ces molécules ont été appliquées aux études dans plusieurs organizations de modèle de comprenant les souris , le Zebrafish et les grenouilles

Morpholinos sont également à l'étude comme thérapeutique pharmaceutique du visée contre les organizations pathogènes du telles que les bactéries ou les virus et pour l'amélioration des maladies génétiques . Ces oligos synthétiques ont été conçus par James E. Summerton (outils de gène de , LLC ) et développés en collaboration avec Dwight D. Weller ( AVI BioPharma Inc.

Structure

Morpholinos sont les molécules synthétiques du qui sont le produit d'une conception de structure normale d'acide nucléique. Habituellement 25 bases de longueur, elles lient aux ordres complémentaires de l'ARN par le standard de base-appareillement d'acide nucléique. Structurellement, la différence entre Morpholinos et ADN est que tandis que Morpholinos ont les bases standard d'acide nucléique, ces bases sont liées aux anneaux de la morpholine au lieu des anneaux de Deoxyribose et liées par des groupes de phosphorodiamidate au lieu des phosphates .

Fonction

Morpholinos ne dégradent pas leurs molécules d'ARN de cible, à la différence de beaucoup de types structuraux antisens (par exemple phosphorothioates, de SiRNA ). Au lieu de cela, acte de Morpholinos par le " ; blocking" stérique ; , liant à un ordre de cible dans un ARN et simplement obtenant de la manière des molécules qui pourraient autrement agir l'un sur l'autre avec de l'ARN. Grenouille griffée africaine (Xenopus ), poussin , et oursin , produisant des embryons de Morphant . Avec les systèmes de livraison cytosoliques appropriés, Morpholinos sont efficace dans la culture de cellules de . au des humains et certains actuellement sont examinés dans les tests cliniques en tant que thérapies anticancéreuses.

Expression de gène normale dans les eukaryotes

Dans les organizations eucaryotiques du , pré-ADN messagère est transcrit au noyau, introns sont épissé par dehors, puis l'ADN messagère mûre est exportée du noyau vers le cytoplasme . La petite sous-unité du ribosome habituellement commence par lier à une extrémité de l'ADN messagère et est jointe là par les facteurs de déclenchement eucaryotiques de divers autres , formant le complexe de déclenchement. Le complexe de déclenchement balaye le long de la rive d'ADN messagère jusqu'à ce qu'il atteigne un codon non-sens , et puis la grande sous-unité des attachés de ribosome à la petite traduction de sous-unité et de d'une protéine commence. Ce processus complet désigné sous le nom de l'expression de gène ; c'est le processus par lequel l'information dans un gène , codé comme ordre des bases en ADN , est convertie en structure d'une protéine. Un Morpholino peut modifier l'épissure ou bloquer la traduction, selon l'ordre bas du Morpholino.

Blocage de la traduction

Limite chapeau des 5 du 5 au ' - la région non traduite de l'ARN de messager (ADN messagère), Morpholinos peut interférer la progression du complexe ribosomal de déclenchement du ' au codon non-sens. Ceci empêche la traduction de la région de codage de la transcription visée (appelée le " ; démantelant le " de ; Expression de gène ). C'est utile expérimentalement quand un investigateur souhaite savoir la fonction d'une protéine particulière ; Morpholinos fournissent des moyens commodes de démanteler l'expression de la protéine et d'apprendre comment cette précipitation change les cellules ou l'organization. Un certain Morpholinos démantèlent l'expression tellement effectivement que, après la dégradation des protéines de préexistence, les protéines visées deviennent indétectables par la tache occidentale (par exemple le schéma 1 de dans :).

Épissure pré-ADN messagère de modification

Morpholinos peut interférer des étapes de transformation du Pré-ADN messagère par l'empêchement épisser-dirigeant de petits complexes nucléaires de ribonucléoprotéines ( SnRNP ) de lier vers leurs cibles aux frontières des introns sur une rive de pré-ADN messagère, ou en bloquant la base nucléophile d'adénine du et en l'empêchant de former la structure de lasso d'épissure, ou par l'interférence l'attache des protéines de normalisation d'épissure telles que les silencieux et les renforceurs d'épissure d'épissure de . L'empêchement de l'attache du snRNP U1 (à l'emplacement de distributeur) ou U2/U5 (à l'emplacement de partie et d'accepteur de polypyrimidine) peut causer le modifié épissant , généralement à l'exclusion des exons de l'ADN messagère mûre. L'optimisation d'une certaine épissure vise des résultats dans des inclusions de l'intron , alors que l'activation des emplacements énigmatiques d'épissure peut mener aux inclusions ou aux exclusions partielles. Des cibles des snRNPs U11/U12 peuvent également être bloquées. La modification d'épissure peut être commodément analysée par amplification en chaîne par réaction renversée-transcriptase ( RT-PCR ) et est vue comme un décalage de bande après l'électrophorèse de gel de des produits de RT-PCR. Ils peuvent bloquer l'activité de Ribozyme . Des fonctions du snRNP U2 et U12 ont été empêchées par Morpholinos. Morpholinos a visé au " ; slippery" ; les ordres d'ADN messagère dans des régions de codage de protéine peuvent induire les déphasages de translation . Les activités de Morpholinos contre cette variété de cibles suggèrent que Morpholinos puisse être employé comme outil d'usage universel pour bloquer des interactions des protéines ou des acides nucléiques avec l'ADN messagère.

Spécificité, stabilité et effets non-antisens

Morpholinos sont devenus un outil standard de précipitation chez les systèmes embryonnaires du animal , qui ont une plus large gamme d'expression de gène que les cellules adultes et peuvent être fortement affectés par une interaction d'au loin-cible. Après les injections initiales dans des embryons de grenouille ou de poissons aux étapes unicellulaires ou de peu de-cellule, des effets de Morpholino peuvent souvent être mesurés cinq jours plus tard, après que la plupart des processus de l'organogenèse et de la différentiation soient au delà, avec les phénotypes observés compatibles à la précipitation de cible-gène. Les oligos de la commande avec des ordres non pertinents ne produisent habituellement aucun changement de phénotype embryonnaire, évidence de l'ordre-spécificité oligo de Morpholino et manque d'effets non-antisens.

les expériences de délivrance d'ADN messagère peuvent souvent reconstituer le Sauvage-type phénotype de aux embryons et fournir l'évidence pour la spécificité d'un Morpholino. Dans une délivrance d'ADN messagère, un Morpholino Co-est injecté avec une ADN messagère cette des codes pour la même protéine que le Morphlino est visé pour démanteler. Cependant, la délivrance ADN messagère a un modifié 5 non traduits ' - UTR (région) de sorte que la délivrance ADN messagère ne contienne aucune cible pour le Morpholino mais pour la région de codage de de la délivrance l'ADN messagère code la protéine d'intérêt. La traduction de la délivrance ADN messagère remplace la production de la protéine qui a été démantelée par le Morpholino. Puisque la délivrance ADN messagère n'affecterait pas les changements phénotypiques dus à la modulation de l'expression de gène d'au loin-cible par le Morpholino, ce retour au sauvage-type phénotype est davantage d'évidence de spécificité de Morpholino.

En raison de leurs épines dorsales complètement artificielles, Morpholinos ne sont pas identifiés par les protéines cellulaires. Le Nucleases ne dégradent pas Morpholinos, ni sont elles ont dégradé en sérum ou en cellules. Morpholinos n'activent pas le Péage-comme les récepteurs et ainsi elles n'activent pas les immuno-réactions innées tel que l'induction de l'interféron ou la réponse de l'inflammation négociée par du N-F-κB. Morpholinos ne sont pas connus pour modifier la méthylation de d'ADN .

Un sujet d'inquiétude dans l'utilisation de Morpholinos est le potentiel pour le " ; outre du target" ; effets. Jusqu'à 18% de Morpholinos semblent avoir des phénotypes connexes parcible comprenant la mort de cellules dans les tissus de Somite de système nerveux central et de des embryons de zebrafish. La plupart de ces effets se sont avérées dues à l'activation du P53 - négocié Apoptosis , et peuvent être supprimées par la Co-injection d'un anti-p53 Morpholino avec le Morpholino expérimental. Il s'avère que ces effets sont détail d'ordre, en tant que dans la plupart des cas si un Morpholino est associé aux effets de non-cible, les 4 la disparité que basse Morpholino ne déclenchera pas ces effets. La question de si un phénotype observé de Morphant est dû à la précipitation prévue ou à une interaction d'au loin-cible peut souvent être abordée en courant une autre expérience pour confirmer que le phénotype morphant observé résulte de la précipitation de la cible prévue. Ceci peut être fait en récapitulant le phénotype morphant avec un deuxième, Morpholino non-recouvert visant la même ADN messagère ou par la confirmation des phénotypes observés au moyen d'une contrainte de mutant ou des méthodes négatives dominantes. Comme mentionné ci-dessus, la délivrance des phénotypes observés par coinjecting une délivrance ADN messagère est, si faisable, un essai fiable de spécificité d'un Morpholino.

La livraison

Pour qu'un Morpholino soit efficace, il doit être livré après la membrane de cellules de dans le cytosol d'une cellule. Une fois dans le cytosol, le Morpholinos librement diffus entre le cytosol et le noyau, comme démontré par l'activité de épisser-modification nucléaire de Morpholinos observée après microinjection dans le cytosol des cellules. Différentes méthodes sont employées pour la livraison dans des embryons, dans les cellules cultivées ou dans les animaux adultes. Un appareillage de Microinjection est habituellement utilisé pour la livraison dans un embryon, avec des injections le plus généralement effectuées à l'étape unicellulaire ou de peu de-cellule ; une méthode alternative pour la livraison embryonnaire est l'électroporation , qui peut livrer des oligos dans des tissus des étapes embryonnaires plus tardives. Les techniques communes pour la livraison dans les cellules cultivées incluent le peptide d'Endo-Bagagiste (qui cause le Morpholino d'être libéré des endosomes ), le système de livraison spécial (using un hétéroduplex Morpholino-ADN et un réactif éthoxylé de la livraison de polyethylenimine) ou le chargement de coup de racloir. La livraison dans les tissus adultes est habituellement difficile, bien qu'il y ait quelques systèmes permettant la prise utile des oligos non modifiés de Morpholino (cellules en soi perméables y compris de muscle provoquées par dystrophie musculaire de Duchenne de ou cellules endothéliales vasculaires soumises à une contrainte pendant l'angioplastie de ballon). La livraison systémique dans beaucoup de cellules dans les organizations adultes peut être accomplie en employant les conjugés covalents des oligos de Morpholino avec des peptides pénétrants de cellules de , et tandis que de la toxicité a été associée aux peptides elles ont été le utilisé in vivo pour la livraison oligo efficace aux doses au-dessous de ceux qui causent la toxicité observée.

Propriété intellectuelle

Outils de gène de , LLC et propriété intellectuelle de réclamation d'AVI BioPharma Inc. sur des aspects de Morpholino oligo.

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