ELISPOT
La tache ( ELISPOT ) d'immunosorbant Enzyme-liée par est une méthode commune pour surveiller des immuno-réactions chez l'homme et des animaux. Elle a été développée par Cecil Czerkinsky en 1983.
L'analyse d'ELISPOT est basée dessus, et a été développée à partir d'une version modifiée de l'immunoessai du ELISA . Des analyses d'ELISPOT ont été à l'origine développées pour énumérer des cellules de B sécrétant les anticorps antigène-spécifiques , et ont été plus tard adaptées pour différentes tâches, particulièrement identification et énumération de Cytokine - production des cellules au niveau unicellulaire. Simplement mise, aux conditions appropriées l'analyse d'ELISPOT permet la visualisation du produit sécréteur des cellules activées ou de réponses d'individu. Chaque tache qui se développe dans l'analyse représente une cellule réactive simple. Ainsi, l'analyse d'ELISPOT fournit (nombre de cellules de réponse) des informations qualitatives (type de protéine immunogène) et quantitatives.
En vertu de la sensibilité exquise de l'analyse d'ELISPOT, l'analyse de fréquence des populations rares de cellules (par exemple, réponses antigène-spécifiques) avant lequel n'étaient pas possibles sont maintenant relativement facile. Cette sensibilité exceptionnelle est en partie étant donné que le produit est rapidement capturé autour de la cellule de sécrétion : avant qu'elle soit diluée dans le surnageant, capturée par des récepteurs des cellules adjacentes, ou dégradée. Ceci rend des analyses d'ELISPOT beaucoup plus sensibles que des mesures conventionnelles d'ELISA. Les limites de la détection sont en-dessous de 1/100.000 rendant l'analyse uniquement utile pour des réponses antigène-spécifiques de surveillance, applicable à un éventail de domaines de la recherche en matière d'immunologie, y compris le cancer, la transplantation, la maladie infectieuse, et la mise au point de vaccin. L'analyse a gagné une augmentation récente de la popularité, particulièrement comme mesure de remplacement pour des réponses du CTL , dans la grande partie parce qu'elle est fiable et fortement - sensible.
Tandis que les techniques d'analyse d'ELISPOT ont existé pour plus de deux avancements de décennies maintenant sont encore faits dans l'analyse. L'analyse moderne d'ELISPOT est typiquement exécutée using les lecteurs d'ELISPOT, qui utilisent des techniques de vision d'ordinateur pour énumérer les cellules activement productrices. Ceci permet à une grande partie du processus d'analyse d'être automatisé, et permet un plus grand niveau d'exactitude que ce qui peut être réalisé using l'inspection manuelle.
Procédé
Comme remarquable ci-dessus, les analyses d'ELISPOT utilisent une technique très semblable à la technique d'analyse d'immunosorbant enzyme-liée par sandwich ( ELISA ). Un anticorps polyclonal monoclonal de capture de ou est enduit aseptiquement sur un PVDF (fluorure de polyvinylidène) - microplate soutenu. Ces anticorps sont choisis pour leur spécificité pour l'analyte en question. Le plat est bloqué, habituellement avec une protéine sérique qui est non-réactive avec des anticorps l'uns des dans l'analyse. Après ceci, des cellules d'intérêt sont plaquées dehors aux densités variables, avec l'antigène ou le mitogène , et alors placées dans 37°C un incubateur humidifié du CO2 pendant une période spécifique.
Cytokine (ou tout autre produit de cellules d'intérêt) sécrété par les cellules activées est capturé localement par l'anticorps enduit sur la haute membrane de la superficie PVDF. Après lavage des puits pour enlever des cellules, des débris, et des composants de médias. Un détail polyclonal d'anticorps de Biotinylated pour l'analyte choisie est ajouté aux puits. Cet anticorps est réactif avec un épitope distinct du cytokine de cible et est utilisé ainsi pour détecter le cytokine capturé. Après un lavage pour éliminer n'importe quel anticorps biotinylated non lié, le cytokine détecté est alors visualisé using une avidine - le HRP , et un substrat de précipitation (par exemple, l'AEC, BCIP / NBT ). Le produit final coloré (une tache, habituellement un bleu noirâtre) représente typiquement une cellule cytokine-productrice individuelle. Les taches peuvent être comptées manuellement (par exemple, avec un microscope de dissection ) ou en utilisant un lecteur automatisé pour saisir les images de microwell et pour analyser le nombre et la taille de tache.
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