Anticorps polyclonal
Les anticorps polyclonaux sont les anticorps qui sont dérivés de différentes lignes des cellules de b. Ils sont un mélange des molécules d'immunoglobuline sécrétées contre un antigène spécifique , chacun de qui identifie un épitope différent .
Production
Ces anticorps sont typiquement produits par l'immunisation d'un mammifère approprié , tel qu'une souris, un lapin ou une chèvre. De plus grands mammifères sont souvent preferred comme quantité du sérum qui peut être recouvrée est plus grande. Un antigène est injecté dans le mammifère. Ceci induit les lymphocytes de b produire le détail des immunoglobulines d'IgG pour l'antigène. Ce IgG est épuré du sérum du du mammifère.En revanche, les anticorps monoclonaux sont dérivés d'une ligne unicellulaire. Beaucoup de méthodologies existent pour la production polyclonale d'anticorps dans les animaux de laboratoire. Des directives institutionnelles régissant les procédures animales d'utiliser-et concernant ces méthodologies sont généralement orientées autour des considérations humanitaires et s'approprient la conduite pour (les agents qui modifient l'effet d'autres agents tout en ayant peu le cas échéant des effets directs une fois donnés seuls) l'usage auxiliaire. Ceci inclut le choix auxiliaire, les itinéraires et les emplacements de l'administration, les volumes d'injection par emplacement et le nombre d'emplacements par animal. Les politiques institutionnelles incluent généralement les volumes permis de sang par collection et mesures de sécurité comprenant la contrainte et la sédation appropriées ou l'anesthésie des animaux pour l'empêchement de dommages aux animaux ou au personnel.
Le but primaire de la production d'anticorps dans les animaux de laboratoire est d'obtenir le titre élevé , les hauts antisérums d'affinité pour l'usage dans l'expérimentation ou les examens de diagnostic. Les adjuvants sont employés pour améliorer ou accroître une immuno-réaction aux antigènes. La plupart des adjuvants prévoient un emplacement d'injection, le dépôt d'antigène qui tient compte d'un à émission lente de l'antigène dans vidanger les ganglions lymphatiques.
Beaucoup d'adjuvants également contiennent ou agissent directement comme : agents tensio-actifs qui favorisent la concentration des molécules d'antigènes de protéine au-dessus d'une grande superficie, et
Choix animal
Les animaux fréquemment utilisés pour la production polyclonale d'anticorps incluent des poulets, des chèvres, des cobayes, des hamsters, des chevaux, des souris, des rats, et des moutons. Cependant, le lapin est l'animal de laboratoire le plus utilisé généralement à cette fin. Le choix animal devrait être basé au moment : la quantité d'anticorps a eu besoin,Des chèvres ou les chevaux sont généralement employés quand de grandes quantités d'antisérums sont exigées. Beaucoup d'investigateurs favorisent des poulets en raison de leur distance phylogénétique des mammifères. Les poulets transfèrent des quantités élevées d'IgY (IgG) dans le jaune d'oeuf et la moisson des anticorps des oeufs élimine le besoin de procédé invahissant de saignement. Les oeufs d'une semaine peuvent contenir 10 fois plus d'anticorps que le volume de sang de lapin a obtenu à partir d'un saignement hebdomadaire. Cependant, il y a quelques inconvénients en employant certain poulet a dérivé des anticorps dans les immunoessais. Le poulet IgY ne fixe pas le composant mammifère C1 de complément et il n'exécute pas comme anticorps de précipitation using les solutions étalons.
Bien que des souris soient employées plus souvent pour la production d'anticorps monoclonal, leur de petite taille empêche habituellement leur utilisation pour des quantités suffisantes de polyclonal, anticorps de sérum. Cependant, des anticorps polyclonaux chez les souris peuvent être rassemblés de l'ascite liquide using n'importe qui d'un certain nombre d'ascite produisant des méthodologies.
En employant des lapins, de jeunes animaux adultes (2.5lbs) devraient être employés pour l'immunisation primaire en raison de la réponse vigoureuse d'anticorps. Les crêtes immunisées de fonction à la puberté et aux réponses primaires à de nouveaux antigènes diminuent avec l'âge. Les lapins femelles sont généralement preferred parce qu'on rapporte qu'ils sont plus dociles et montent une immuno-réaction plus vigoureuse que des mâles. Au moins deux animaux par antigène devraient être employés en employant les animaux exogenes. Ce principe ramène l'échec total potentiel résultant de la non-réponse aux antigènes de différents animaux.
Préparation d'antigène
La taille, l'ampleur de l'agrégation et la nativité relative des antigènes de protéine peuvent tout nettement affecter la qualité et la quantité d'anticorps produites. De petits polypeptides (ku <10) et antigènes sans protéines doivent généralement être conjugués ou réticulés protéines à de plus grandes, immunogènes, de porteur pour augmenter l'immunogénicité et pour fournir des épitopes à cellule T du . Généralement, plus la protéine immunogène le meilleur est grande. De plus grandes protéines, même dans un peu, habituellement résultat dans un meilleur enclenchement d'antigène présentant l'antigène traitant des cellules pour une immuno-réaction satisfaisante. L'injection des protéines solubles et non-agrégées a une probabilité plus élevée d'induire la tolérance plutôt qu'une réponse satisfaisante d'anticorps.Le hemocyanin de ventouse de trou de la serrure (KLH) et l'albumen de sérum de boeuf sont deux protéines de porteur employées couramment. la Poly-L-lysine également a été employée avec succès comme épine dorsale pour des peptides. Bien que l'utilisation de la Poly-L-lysine ramène ou élimine la production des anticorps aux protéines étrangères, elle peut avoir comme conséquence l'échec de la production peptide-induite d'anticorps. Récemment, des liposomes ont été avec succès employées pour la libération de petits peptides et cette technique est plus efficace que la livraison avec les adjuvants huileux d'émulsion.
Quantité d'antigène
Le choix de la quantité d'antigène pour l'immunisation varie avec les propriétés de l'antigène et de l'adjuvant choisis. Généralement le microgramme aux quantités de milligramme de protéine en adjuvant sont nécessaire pour obtenir de hauts anticorps de titre. Le dosage d'antigène est généralement des espèces, plutôt que le poids corporel, associé. La soi-disant « fenêtre » de l'immunogénicité dans le chaque des espèces est large mais trop ou trop peu d'antigène peut induire la tolérance, la suppression ou la déviation immunisée vers l'immunité cellulaire plutôt qu'une réponse humorale satisfaisante. Des niveaux optimaux et habituels d'antigène de protéine pour immuniser des espèces spécifiques ont été rapportés dans les gammes suivantes : lapin, µg 50-1000 ;L'affinité des anticorps de sérum augmente avec du temps (mois) après injection des mélanges d'antigène-adjuvant et pendant que l'antigène dans le système diminue. Les dosages employés couramment d'antigène pour le « propulseur » ou les immunisations secondaires sont habituellement un demi- pour égaler les dosages d'amoricage. Les antigènes devraient être exempts de sous-produits et de produits chimiques préparatoires tels que le gel de polyacrylamide, le SDS, l'urée, l'endotoxine, les particules et les extrémités du pH.
Anticorps de peptide
Quand un peptide est employé pour produire de l'anticorps, il est extrêmement important de concevoir les antigènes correctement. Il y a plusieurs ressources qui peuvent faciliter la conception comme les compagnies qui offrent ce service. Expasy a agrégé un ensemble d'outils publics sous sa page de ProtScale qui exigent un certain degré de la connaissance d'utilisateur de diriger. Pour un outil de marquage de peptide plus simple il y a un outil de profileur d'antigène disponible qui te permettra de marquer différents ordres de peptide basés sur un épitope de relation traçant la base de données des immunogènes précédents employés pour produire des anticorps. En conclusion, en règle générale les peptides devraient suivre quelques critères de base.
En examinant des peptides pour la synthèse et l'immunisation, on lui recommande que certains résidus et ordres soient dus évité aux problèmes potentiels de synthèse. Ceci inclut certaines des caractéristiques plus communes :
• Extrêmement longtemps répétitions du même acide aminé (par exemple RRRR) • Doublets de la sérine (s), de la thréonine (t), de l'alanine (a), et de la valine (v) • Finissant ou commençant un ordre avec de la proline (p) • Glutamine (q) ou asparagine (n) aux n-terminus • Peptides plus de pesés avec les résidus hydrophobes (par exemple V, A, L, I, etc…)
Réactivité
Les investigateurs devraient également considérer le statut de nativité des antigènes de protéine une fois utilisés comme immunogènes et réaction à des anticorps produits. Les anticorps aux protéines indigènes réagissent mieux avec les protéines indigènes et les anticorps aux protéines dénaturées réagissent mieux avec les protéines dénaturées. Si des anticorps obtenus doivent être employés sur des taches de membrane (protéines soumises à dénaturer des conditions) puis des anticorps devraient être faits contre les protéines dénaturées. D'une part, si des anticorps doivent être employés pour réagir avec une protéine indigène ou pour bloquer un emplacement actif de protéine, puis des anticorps devrait être fait contre la protéine indigène. Les adjuvants peuvent souvent changer la nativité de la protéine. Généralement, les antigènes absorbés de protéine dans un adjuvant huile/eau préformé de l'émulsion , maintiennent une plus grande structure indigène de protéine que ceux dans des émulsions d'eau-dans-huile.
Asepticity
Des antigènes devraient toujours être préparés using les techniques qui s'assurent qu'ils sont exempts de contamination microbienne. La plupart des préparations d'antigène de protéine peuvent être stérilisées par le passage par un filtre 0. Les abcès septiques se produisent souvent aux emplacements d'inoculation des animaux quand des préparations souillées sont employées. Ceci peut avoir comme conséquence l'échec de l'immunisation contre l'antigène visé.
Adjuvants
ewrite Il y a beaucoup choix immunologique disponible dans le commerce des adjuvants de des adjuvants spécifiques ou les types varie selon s'ils doivent être employés pour la recherche et la production d'anticorps ou dans la mise au point de vaccin. Les adjuvants pour l'usage vaccinique doivent seulement produire les anticorps protecteurs et la bonne mémoire systémique tandis que ceux pour que le besoin de production d'antisérum induise rapidement le titre élevé, hauts anticorps d'avidité. Aucun adjuvant n'est idéal pour tous les buts et tout a des avantages et des inconvénients. L'utilisation auxiliaire généralement est accompagnée des effets secondaires indésirables de varier la sévérité et la durée. La recherche sur de nouveaux adjuvants se concentre sur les substances qui ont la toxicité minimale tout en maintenant l'immunostimulation maximum. Les investigateurs devraient toujours se rendre compte de la douleur potentielle et affliger associé à l'utilisation auxiliaire dans les animaux de laboratoire.Plus souvent les adjuvants utilisés pour la production d'anticorps sont Freund, le système auxiliaire de Ribi et Titermax.
Les adjuvants de Freund
Il y a deux types de base d'adjuvant complet des adjuvants Freund de Freund de (FCA) et d'adjuvant inachevé de Freund (FIA). FCA est une émulsion d'eau-dans-huile qui localise l'antigène pendant des périodes de dégagement jusqu'à pendant 6 mois. Il est formulé avec du d'huile minérale, le monoleate de mannide d'agent tensio-actif et la tuberculose de mycobactérie de tuée par chaleur, le butyricum de mycobactérie de ou leurs extraits (pour l'agrégation des macrophages à l'emplacement d'inoculation). Cet adjuvant efficace stimule l'immunité communiquée par les cellules et humorale avec l'induction préférentielle de l'anticorps contre des épitopes des protéines dénaturées. Bien que FCA ait historiquement été l'adjuvant le plus employé couramment, il est l'un des agents plus toxiques dus à d'huile minérale non métabolisable et il induit des réactions granulomateuses. Son utilisation est limitée aux animaux de laboratoire et elle devrait être employée seulement avec des antigènes faibles. Elle ne devrait pas être employée plus d'une fois dans un animal simple puisque les inoculations multiples de FCA peuvent causer des réactions systémiques graves et des immuno-réactions diminuées. L'adjuvant inachevé de Freund a la même formulation que FCA mais ne contient pas la mycobactérie ou ses composants. La FIA habituellement est limitée aux doses de rappel de l'antigène depuis lui normalement beaucoup moins efficace que FCA pour l'induction primaire d'anticorps. Les adjuvants de Freund sont normalement mélangés aux parties égales de préparations d'antigène aux émulsions d'écurie de forme.
Système d'adjuvant de Ribi
Les adjuvants de Ribi sont des émulsions d'huile en eau où des antigènes sont mélangés aux petits volumes d'huile métabolisible (squalène) qui sont alors émulsionnés avec salin contenant le Tween 80 d'agent tensio-actif. Ce système contient également les produits mycobactériens de raffinage (facteur de corde, squelette de paroi cellulaire) comme immunostimulants et lipide bactérien A. Trois formulations orientées par espèces différentes du système auxiliaire sont disponibles. Ces adjuvants agissent l'un sur l'autre avec des membranes des cellules immunisées ayant pour résultat l'induction de cytokine, qui augmente la prise, le traitement et la présentation d'antigène. Ce système auxiliaire est beaucoup moins toxique et moins efficace que FCA mais induit généralement des quantités satisfaisantes de hauts anticorps d'avidité contre des antigènes de protéine.
Titermax
Titermax représente une plus nouvelle génération des adjuvants qui sont moins toxique et ne contiennent aucun matériaux biologiquement dérivé. Il est basé sur des mélanges d'agent tensio-actif agissant, linéaires, blocs ou chaînes du polyoxypropylene non ionique de copolymères (POP) et polyoxyéthylène (POE). Ces copolymères sont moins toxiques que beaucoup d'autres matériaux d'agent tensio-actif et ont des propriétés auxiliaires efficaces qui favorisent le chimiotactisme, l'activation de complément et la production d'anticorps. L'adjuvant de Titermax forme une émulsion d'eau-dans-huile de microparticulate avec du copolymère et le pétrole métabolisible de squalène. Le copolymère est enduit des particules stabilisantes de silice d'émulsion qui tient compte de l'incorporation des grands nombres d'une large variété de matériaux antigéniques. Le copolymère actif auxiliaire forme les surfaces hydrophiles, qui activent le complément, les cellules immunisées et la plus grande expression des molécules importantes d'histocompatibilité de la classe II sur des macrophages. Titermax présente l'antigène sous une forme fortement concentrée au système immunitaire, au lequel a souvent comme conséquence des titres d'anticorps comparables ou plus haut que FCA.Specol : Le Specol est une eau en adjuvant d'huile fait en épuré d'huile minérale. On a rapporté qu'induit l'immuno-réaction comparable à l'adjuvant de Freund de chez le lapin et tout autre animal de recherches tout en produisant peu de lésions histologiques.
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